梵蒂冈抄本是世界上现存最古老、最重要的希腊语圣经手抄本之一，得名于其存放地梵蒂冈教廷图书馆。此抄本完成于公元4世纪，书写材质为羊皮纸，以希腊语安色尔字体抄写而成，品质极高。直到另一著名版本的圣经手抄本西奈抄本被发现之前，在世界上没有任何一部希腊语圣经手抄本的质量能与梵蒂冈抄本相当。

　　梵蒂冈抄本收录了除玛加伯1-4和玛拿西祷言之外的完整版七十士译本。其中创1:1-46:28a(计31张)、诗105:27-137:6b(计20张)遗失，由后人于15世纪时补齐。王下2:5-7、10-13由于一张纸部分撕裂亦已遗失。抄本《旧约》顺序如下：创世纪至编年纪下顺序正常，以下为厄斯德拉上、厄斯德拉下、圣咏集、箴言篇、训道篇、雅歌、约伯传、智慧篇、德训篇、艾斯德尔传、友弟德传、多俾亚传、小先知书欧瑟亚至玛拉基亚、依撒意亚书、耶肋米亚书、巴路克、哀歌、耶肋米亚书信、厄则克耳和达尼尔。

　　梵蒂冈抄本现存的《新约》部分包括四福音书、宗徒大事录、大公书信、保罗书信和希伯来书。不过其中缺少了弟茂德前书、弟茂德后书、弟铎书、费肋孟书和若望默示录。这些缺失的部分被15世纪的小写字体版本抄本替代了。其他缺失的章节包括玛16:2b-3、谷16:9-20、路22:43-44、若5:4、7:53-8:11和罗16:24。

　　梵蒂冈抄本以四开形式装订，计有羊皮纸共759张。此抄本最初由830张书页组成，现今共有71张遗失，剩余《旧约》617张，《新约》142张。抄本的形式为每页分3栏，42行，每行16-18个字母，书页长度和宽度均为27厘米。这种每页分3栏的抄写形式在希腊语圣经抄本中非常罕见。由于这部抄本很少被使用，所以保存状态比较好。抄本中希腊文的抄写连贯而整洁，极少使用标点符号，除了一些间隔用的空白。抄本中的重音符号和变音符号是后人增添进去的。

　　梵蒂冈抄本由三名抄写人共同完成，其中两人抄写《旧约》，一人抄写《新约》。在抄本《新约》部分的书页边缘空白处有很多奇怪的两点符号，似乎是为了标出原文不确定的地方，全书共有795个此符号(另有40处疑似此符号)，标示这些符号的时间学术界尚没有定论。在1512页，希1:3的旁边空白处有一句有趣的注脚：“傻瓜无赖!你就不能不改动原文的意思吗!”("ἀμαθέστατε καὶ κακέ, ἄφες τὸν παλαιόν, μὴ μεταποίει" )说明此处的抄写错误不论是有意的还是无意的，对于其他抄写人来说都是一个十分显著的错误。

　　梵蒂冈抄本的成书地点至今仍无定论，可能的地点包括罗马、意大利南部、亚历山大港和卡萨里亚等。